PML-RARalpha gene detection method optimization for quantitative PCR

Hybrid gene PML-RARα is the molecular target found in most cases of acute promyelocytic leukemia (APL) and has been used for diagnosis and minimal residual disease studies. The standard molecular technique employed is qualitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), but with the emergence of real time PCR (Q-PCR), PML-RARα gene detection approaches have been described allowing transcript detection, with the methodological advantage of eliminating post-PCR processing. However, current protocols report the use of expensive fluorescent labeled probes, limiting its routine application in the laboratory. The objective of this study was to optimize PML-RARalpha gene detection method for Q-PCR, using SYBR® Green fluorescent dye. The analysis was performed with NB4 cellular lineage cDNA. Thermal cycling protocols, cDNA synthesis with random or specific primer and different MgCl2 and amplification primers concentrations were tested. Results show that amplification improved in the following conditions: 2 mM MgCl2, 10 pmol primers and cDNA synthesized with specific primer. There were no significant differences using annealing temperature (58ºC/30 s) followed by extension (72ºC/30 s) or annealing associated with extension as a single step (60ºC/45 s). This paper demonstrates the optimization of PML-RARα gene detection for Q-PCR studies using a technique considered sensitive and less expensive for routine use in the laboratory.

O gene híbrido PML-RARα é o marcador molecular presente na maioria dos casos de leucemia aguda promielocítica (LAP), sendo útil ao diagnóstico e ao estudo da doença residual mínima. A técnica molecular empregada como rotina laboratorial é a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) qualitativa, porém com o surgimento da PCR em tempo real (Q-PCR), foram descritas abordagens de detecção do gene PML-RARalfa possibilitando a quantificação de transcritos, com a vantagem metodológica da eliminação do processamento pós-PCR. No entanto, os protocolos relatam o uso de sondas fluorescentes de custo elevado para a rotina clínica, limitando sua aplicação. Este estudo teve como objetivo otimizar o método de detecção do gene PML-RARα para Q-PCR, utilizando como sistema de marcação fluorescente o intercalante SYBR® Green. A análise foi realizada com cDNA da linhagem celular NB4, tendo sido testados protocolos de termociclagem, síntese de cDNA com primer randômico ou específico e diferentes concentrações de MgCl2 e primers para amplificação. Os resultados mostraram amplificação mais eficiente nas seguintes condições: 2 mM MgCl2, 10 pmol de primers e cDNA sintetizado com primer específico. Não houve diferença na utilização de etapas para anelamento (58ºC/30 s) seguido de extensão (72ºC/30 s) ou etapa única de anelamento associado à extensão (60ºC/45 s). Esses resultados demonstram a otimização da detecção do gene PML-RARα para Q-PCR através de um método considerado sensível e de baixo custo para a rotina laboratorial.

Identifying sugarcane expressed sequences associated with nutrient transporters and peptide metal chelators

A absorçäo de nutrientes pelas plantas é um processo ativo, requerendo energia para o acúmulo de nutrientes essenciais em níveis mais elevados nos tecidos vegetais do que na soluçäo do solo, enquanto que a presença de metais tóxicos ou excesso de nutrientes requererem mecanismos para modular o acúmulo de íons. Genes que codificam transportadores de íons, isolados de plantas e de leveduras, foram usados para identificar homólogos presumíveis no banco de dados de seqüências expressas de cana-de-açúcar (SUCEST). Cinco consensos de grupos de seqüências com homologia a genes de transportadores de fosfato de alta afinidade foram identificados. O consenso de um dos grupos permitiu a prediçäo da proteína completa, com 541 amino ácidos e 81 por cento de identidade com o gene NtPT1 de Nicotiana tabacum, consistindo de 12 domínios transmembrana divididos por uma grande regiäo hidrofílica. Homólogos presumíveis a genes transportadores de micronutrientes de Arabidopsis thaliana também foram detectados em algumas bibliotecas do SUCEST. A absorçäo de ferro em gramíneas envolve a liberaçäo de um composto fito-sideróforo, ácido mugenêico (MA), que complexa com FeÝ+, sendo entäo absorvido por um transportador específico. Seqüências expressas (EST, expressed sequence tag) de cana-de-açúcar homólogas aos genes que codificam as três enzimas da via de biossíntese do ácido mugenêico (nicotianamina sintase; nicotianamina transferase; e a sintetase presumível do ácido mugenêico ids3), além de um transportador presumível de FeÝ+-fito-sideróforo foram também detectados. Sete grupos de seqüências de cana-de-açúcar foram identificados com grande homologia com os membros da família de genes ZIP (ZIP1, ZIP3, ZIP4, IRT1 e ZNT1), enquanto que quatro grupos apresentaram homologia com ZIP2 e três com ZAT. Seqüências homólogas aos membros de uma outra família de genes, Nramp, que codificam transportadores de metais de ampla espectro, foram também detectados com expressäo constitutiva. Transcritos parciais homólogos aos genes que codificam y-glutamilcisteína sintetase, glutationa sintetase e fitoquelatina sintase (responsáveis pela biossíntese da proteína quelante de metais, fitoquelatina) e todos os quatro tipos do outro principal peptídeo quelante de metais em plantas, metalotioneína (MT), foram identificados: MT do tipo I sendo a mais abundante, seguido pela MT do tipo II, com padräo de expressäo similar àquele descrito para MT de Arabidopsis.